Development of a light tunable differentiation system for the creation and control of microbial consortia in S. cerevisiae, its single cell characterization for development of predictive models, and application to heterologous expression - Inria - Institut national de recherche en sciences et technologies du numérique Access content directly
Theses Year : 2021

Development of a light tunable differentiation system for the creation and control of microbial consortia in S. cerevisiae, its single cell characterization for development of predictive models, and application to heterologous expression

Développement d'un système de différenciation modulable par la lumière pour la création et le contrôle de consortiums microbiens dans S. cerevisiae, sa caractérisation en cellule unique pour le développement de modèles prédictifs, et son utilisation pour l'expression hétérologue

Abstract

Les consortiums microbiens artificiels cherchent à exploiter la division du travail pour optimiser des fonctions et possèdent un immense potentiel pour la bioproduction. Les approches de co-culture, le mode préférentiel pour générer des consortiums, restent limitées dans leur capacité à donner naissance à des consortiums stables ayant des compositions précisément ajustées. J'ai développé ici un système de différenciation artificielle dans la levure boulanger capable de générer à partir d'une seule souche des consortiums microbiens stables avec des fonctionnalités choisies et ayant une composition définie par l'utilisateur dans l'espace et dans le temps, grâce à une modification génétique pilotée par optogénétique. Grâce à une dynamique rapide, reproductible et ajustable par la lumière, mon système permet un contrôle dynamique de la composition des consortiums dans des cultures continues pendant de longues périodes. Je démontre également que notre système peut être étendu de manière simple pour donner naissance à des consortiums avec de multiples sous-populations. Cette stratégie de différenciation artificielle établit un nouveau paradigme pour la création de consortiums microbiens complexes qui sont simples à mettre en oeuvre, contrôlables avec précision et polyvalents à utiliser. En plus de cela, j'ai caractérisé le système au niveau de la cellule unique dans différents contextes en changeant la structure du bruit du facteur de transcription optogénétique qui induit la différenciation. J'ai découvert que le changement de la structure du bruit introduisait un couplage complexe entre les niveaux de la population de cellule et des cellules individuelles, qui ne peut être prédit par un simple modèle d'équations différentielles ordinaires. L'utilisation d'un modèle stochastique bien caractérisé a permis de rétablir la prévisibilité. Enfin, j'ai couplé le système de différenciation avec un system d'arrêt de croissance et de bioproduction de sorte que les cellules différenciées arrêtent de croître et commencent à produire une protéine d'intérêt. J'ai comparé l'efficacité de l'approche basée sur la différenciation avec des équivalents constitutifs et inductibles. J'ai constaté que la production n'était pas monotone par rapport à la fraction de différenciation mais qu'elle pouvait surpasser l'expression induite par un promoteur constitutif fort.
Artificial microbial consortia seek to leverage division-of-labour to optimize function and possess immense potential for bioproduction. Co-culturing approaches, the preferred mode of generating a consortium, remain limited in their ability to give rise to stable consortia having finely tuned compositions. Here, I developed an artificial differentiation system in budding yeast capable of generating stable microbial consortia with custom functionalities from a single strain at user-defined composition in space and in time based on optogenetically-driven genetic rewiring. Owing to fast, reproducible, and light-tunable dynamics, my system enables dynamic control of consortia composition in continuous cultures for extended periods independently of the cell density. I further demonstrate that our system can be extended in a straightforward manner to give rise to consortia with multiple subpopulations. This artificial differentiation strategy establishes a novel paradigm for the creation of complex microbial consortia that are simple to implement, precisely controllable, and versatile to use. In addition to this, I characterized the system at the single cell level in different genetic contexts by changing the noise structure of the optogenetic transcription factor that drives differentiation. I found that changing the noise structure introduced complex coupling between the population and the single cell level, which cannot be predicted by a simple population model. A stochastic model of differentiation composed in a stochastic model of plasmid fluctuations not only restored predictability, but revealed mechanistic insights into the functioning of the system. The latter was exploited to demonstrate control of expression of a constitutively expressed gene (proxy for plasmid copy number). Lastly, I coupled the differentiation system with a growth arrest and production module such that differentiated cells stop growing and start producing a protein of interest. Growth arrest was effected via hijacking of the mating pheromone pathway and production was carried out by an orthogonal transcription factor. I developed a light inducible reference to assess the increase in production upon growth arrest. Comparing the efficiency of the differentiation-based approach with constitutive and inducible counterparts, I found that production was non-monotonic with respect to differentiation fraction and could outcompete constitutive expression. However, production did not increase upon growth arrest.
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Chetan Aditya. Development of a light tunable differentiation system for the creation and control of microbial consortia in S. cerevisiae, its single cell characterization for development of predictive models, and application to heterologous expression. Quantitative Methods [q-bio.QM]. Université de Paris, 2021. English. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-03612653⟩
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